tincion de gram

tincion de gram

OBJETIVO

Conocer la técnica de tinción de Gram., conocer el procedimiento y observar las bacterias en microscopio clasificándolas en Gram. Positivas y Gram. Negativas.Utilizar correctamente los materiales en esta técnica de tinción.

MATERIALES

Mesa de trabajo

Frotis ya realizado

Soluciones de,

cristal violeta,

yodo

lugol,

acetona,

safranina.

Microscopio

2 mecheros de bunsen

Aceite de inmersión

Asas bacteriológicas

Agua destilada

Vaso de precipitado de 50 ml

Cajas petri con medio de cultivo

Campo de esterilización

Papel secante

Torundas de algodón

introduccion :

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram. positivas como Graham negativas).El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante.Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo.Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos.

TECNICA DE TINCION DE GRAM:

prepara el frotis y fijar a calorcolocar la preparación con la solución de cristal violeta sumergirla durante(1mn)lavar con solución yodada (lugol)cubrir el frotis durante con solución lugol durante (1mn)escurrir y decolorar con alcohol hasta que no arrastre mas cristal violetalavar con agua corrientecontrastar con la solución safranina lavar con agua corriente y secar al aireobservar con el microscopio con una gota de aceite de inmersión en objetivo (100x)

DESARROLLO:

Los materiales como las asas bacteriológicas no tienen nada que ver con la tinción de Gram., solo se volvieron a poner ala mesa por que algunos de los alumnos no pudieron completar la práctica a su tiempo y si había algún error en la tinción se tenía la oportunidad de volver hacer el frotis e intentar de nuevo la tinción.Se llevo el portaobjetos al lavamanos, se colocaron recipientes con las soluciones de (acetona, yugol, cristal violeta, safranina), se tomo el portaobjetos y se sumergió en el recipiente donde contenía el cristal violeta durante 1mn, después se sumergió en el yodo lugol durante 1mn, se lavo con la acetona hasta que ya no escurriera mas cristal violeta, posteriormente se sumergió en la safranian durante 1mn y finalmente se lavo con agua corriente, se seco al aire libre y séle coloco una gota de inmersión para fijarlo en el microscopio con objetivo 1000x.