ELAVORACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Objetivo

El objetivo de esta practica es a aprender como saber cuanto producto del medio de cultivo se vaciará a las cajas petri, además como poder utilizar los materiales de laboratorio adecuadamente y no hacer equivocaciones en las futuras practicas.

Materiales

- 2 mecheros de bunsen

- Medio de cultivo

- Balanza Granataria

- Matraz Erlenmeyer 200ml

- Vaso de precitado

- Probeta graduada 100 ml

- Vidrio de reloj

- Torundas de algodón

- Papel secante

- Papel blanco

- Agua destilada

- Autoclave

Desarrollo

Se utilizo la regla de tres para saber la cantidad de gramos que vamos a necesitar.

Después se peso en el vidrio de reloj y se deposito directamente al matraz erlenmeyer de 250ml.

Séle depositaron 75 ml de agua destilada al matraz para 3 cajas petri con 25 ml cada una.
Se dejo reposar de acuerdo ala instrucciones del medio de cultivo,

después se utilizaron guantes especiales y se paso por encima de la llama a fuego de muñeca hasta que este tuviera una ebullición.

Una vez teniendo la ebullición se dejaba reposar durante 1 minuto, se etiquetaba, se tapaba con torundas de algodón y se pasaba a la autoclave.

Técnica de esterilización:

Utilizamos la técnica de esterilización colocando el medio de cultivo en el matraz erlenmeyer en forma liquida en el autoclave, el medio de cultivo tenia un color rojo.

Durante 20 minutos el autoclave estuvo a 15 libras de presión, un compañero estuvo calibrando el autoclave para que este no pasara de las 15 libras de presión.Una vez que quedo esterilizado el medio de cultivo en forma liquida, se retiro de la autoclave y se paso ala mesa, esta ya teniendo un campo de esterilización con 2 mecheros encendidos y un papel blanco.

Se realizo el vaciado en cajas petri poniendo en cada una 20 ml de medio de cultivo en forma liquida, una ves vaciado el contenido en las cajas petri se dejo reposar manteniendo los mecheros encendidos y colocando las cajas petri sobre tapadas para que estas se hicieran en forma sólida, se etiquetaban y se ponían en el refrigerador.

ELEMENTOS INORGANICOS

CLORURO:_ es necesario para la elavoracion de acido clorhidrico del tejido gastrico

SODIO:_ Intervienen en la regulacion del balanceo hidrico favoreciendo la relacion del agua.

POTASIO:_actua en el balanseo hidrico favoreciendo la eliminacioin del el agua .

YODO:_ Necesario para que la glandula de tiroides elabore la secresion hormonal que regula el metabolismo

HIERRO:_ Impresindible para la formacion de la hemorragea de los globulos rojos

CALSIO Y FOSFORO:_ constituyen la parte inorganica de los huesos

EL CO2:_fundamental para el proceso de la fotosintesis

moleculas inorganicas

cloruro de sodio NaCl

agua H2O

amoniaco NH3

anhidridocarbonico CO2

tincion de gram

tincion de gram

OBJETIVO

Conocer la técnica de tinción de Gram., conocer el procedimiento y observar las bacterias en microscopio clasificándolas en Gram. Positivas y Gram. Negativas.Utilizar correctamente los materiales en esta técnica de tinción.

MATERIALES

Mesa de trabajo

Frotis ya realizado

Soluciones de,

cristal violeta,

yodo

lugol,

acetona,

safranina.

Microscopio

2 mecheros de bunsen

Aceite de inmersión

Asas bacteriológicas

Agua destilada

Vaso de precipitado de 50 ml

Cajas petri con medio de cultivo

Campo de esterilización

Papel secante

Torundas de algodón

introduccion :

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram. positivas como Graham negativas).El lugol está formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual está presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina)Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante.Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo.Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos.

TECNICA DE TINCION DE GRAM:

prepara el frotis y fijar a calorcolocar la preparación con la solución de cristal violeta sumergirla durante(1mn)lavar con solución yodada (lugol)cubrir el frotis durante con solución lugol durante (1mn)escurrir y decolorar con alcohol hasta que no arrastre mas cristal violetalavar con agua corrientecontrastar con la solución safranina lavar con agua corriente y secar al aireobservar con el microscopio con una gota de aceite de inmersión en objetivo (100x)

DESARROLLO:

Los materiales como las asas bacteriológicas no tienen nada que ver con la tinción de Gram., solo se volvieron a poner ala mesa por que algunos de los alumnos no pudieron completar la práctica a su tiempo y si había algún error en la tinción se tenía la oportunidad de volver hacer el frotis e intentar de nuevo la tinción.Se llevo el portaobjetos al lavamanos, se colocaron recipientes con las soluciones de (acetona, yugol, cristal violeta, safranina), se tomo el portaobjetos y se sumergió en el recipiente donde contenía el cristal violeta durante 1mn, después se sumergió en el yodo lugol durante 1mn, se lavo con la acetona hasta que ya no escurriera mas cristal violeta, posteriormente se sumergió en la safranian durante 1mn y finalmente se lavo con agua corriente, se seco al aire libre y séle coloco una gota de inmersión para fijarlo en el microscopio con objetivo 1000x.

clasificacion de bacterias

TINCION DE WRIGTH

La tinción de Wright

es una tinción de tipo Romanowsky.
Es extremadamente importante en el laboratorio de hematología este tipo de tinción, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de información a partir del examen de un frotis de sangre periférica bien teñido
Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B
La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y
Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico
La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

tincion negativa

TINCION NEGATIVA O TINTA CHINA

Tinción negativa o tinta china es una técnica de microscopía

que permite contrastar las muestras mediante una

sustancia opaca a los fotones (microscopía óptica)

o a los electrones (microscopía electrónica). En el primer

caso, se emplea nigrosinao tinta china; para el caso de bacterias que esporulan, esta técnica permite visualizar

las esporas como entes refringentes sobre un campo de fondo

oscuro. En caso de microscopía electrónica de transmisión,

se emplean sustancias de alto número atómico que, por tanto,

resultan opacas a los electrones transmitidos. Típicamente,

estas sustancias son acetato de uranilo, citrato de plomo o molibdato de amonio. Al eletrónico, esta técnica permite visualizar virus

flagelos, bacterias y otros entes de escaso tamaño.

tincion simple

tincion simple

AZUL DE METILENO

tincion positiva:

permite tenir el interior celular.

tine microorganismos procarioticos vivos o muertos .

Los eucarioticos solo pueden tenir su estan muertos.

algunas estructuras, como los corpusculos metacromaticos, se tinen mas intensamente con este colorante que el resto de la celula .

tincion directa e indirecta

tincion Directa

el colorante interacciona directamente con el sustrato.

tincion indirecta

se hace interaccionar en primer lugar una sustancia

quimica denominada "mordiente" con el sustrato la cual permite

la posterior interaccion de colorante.

usualmente los mordientes son sales , hidroxidos o alumbres de

metales bivrantes o trivalentes

tinciones selectivas

Se basan en el hecho de que distintas estructuras

celulares tienen distinta
composición química, de modo que se tiñen selectivamente

con ciertos colorantes.

Ejemplo;tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares,

de corpúsculos metacromáticos.
Pueden utilizarse uno o más colorantes.

TINCIONES DIFERENCIALES

Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que

se usan para diferenciar de manera mas explicita los microorganismos.

Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen

de más de una sustancia tintórea. En algunas técnicas de coloración,

las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en

bacteriología son las de Gram y la tinción ácido-resistente.

Ambas tinciones se utilizan para obtener información acerca de la

composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas.

BACTERIAS OXIDATIVAS

Las microbacterias son bacterias aerobias y no moviles

con exepcion de las especie M.Matium que a mostrado ser movil dentro

de los macrofagos , tienen acido- alcohol resistencia no producen esporas ni capsulas

y suelen considerarse gram- positivas.

aquellas bacterias no parecen en la categoria gram positiva desde un

punto de vista empirica.

M. LEPTAMATOSIS

M. ABSCESSUS

M. AFTICANUM

M. ASIATICOM

MYCOBACTERIUM AUIUM CPMLEX (MAC)

M. BOVIS

M. CHELANOE

M. FORTUIRUM

M.GORDANUE

M. HAEMOPHILLIUM

M. KANSASII

M. LEPRAE

BACTERIAS FERMENTATIVAS

son microorganismos capases de llevar

el proceso de hidrolisis, mediante la accion

de enzimas capacres de hidroliza la materia

poliomelitica ( proteinas,gases y carbohidratos)

llevan un proceso catabolico de oxidacion incompleta,

totalmente angerobico, siendo el producto final de

un compuesto organico.

pertenece a la familia peritrichinge que comprende

aquellas bacterias cuya vida movilidad sse conosigue

mediente una flagelacion peritrica.

CLASTRODIUM STAPHYLOCOCCUS AUREUS

LACTOBACILLOS MYCOBACTERIUM

ESCHERICHEA ACTINOMYCES

BACILLOS CORYNEBACTERIUM

PSEUDOMONAS

SARCINA

REPASO

la nom. CSSA 0359.01 nos referencia sobre:

uso de muestras citologicas

La Nom. 166-SSAI-1997 nos habla de :

funcionamiento de los laboratorios

La Nom-005-STPS-1998 es relativo a :

seguridad e higiene

la Nom. 087-ECOL-2002 nos indica sobre :

manejo del RPBI

La ISO-15189-2003 nos habla de :

estandarizacion que corresponde a la acreditacion de los laboratorios

Menciona cuales son las tecnicas de tincion diferencial y tecnica selectiva

tincion de gram

tincion de acido- resistente

clasificacion de medios de cultivo:

solidos

liquidos

selectivos

diferenciales

enriquesidos

nutritivos

transporte de pruebas bioquimicas